聚焦离子束（FIB）用于磨去细胞材料，留下的部分就是薄切片。在这篇博文中，我们将解释使用聚焦离子束和冷冻电镜以获取优质薄切片的一些重要步骤和参数。
样品被转移到聚焦离子束和冷冻电镜后的第一步是获取载网的高分辨率概览图像，以确定铣削目标。铣点应在载网中点周围约600μm的半径内，从而确保薄切片可以用于冷冻电子断层扫描。对于哺乳动物细胞，建议选择孤立的细胞，以避免不对电子透明的区域。相反，像酵母菌和细菌这样的小细胞应该聚集在一起，以产生足够大的体积来创建一个薄切片。细胞最好位于载网方块的中心，覆盖着完整的碳膜，以确保样品在样品转移过程中不会丢失 [1] 。
这时候，我们还可以选择性地叠加冷冻荧光显微镜（cryo-FLM）图像，以找到一个特定的感兴趣的区域（ROI），同时指导薄切片的铣削 [2,3] 。然而，在此工作流程中加入冷冻荧光显微镜是很有挑战的，因为我们将引入一个额外的转移步骤，从而增加样品受污染的风险。在理想情况下，样品在铣削后还需要用冷冻荧光显微镜再次进行检查，以确保感兴趣区域没有被铣削掉 [4] ，但这个做法是非常危险的，目前的研究都很少这样做。一套集成在（冷冻）聚焦离子束和扫描电子显微镜（FIB/SEM）腔室中的倒置荧光显微成像系统，比如Delmic的METEOR，对于解决这个问题是大有助益的！
确定了铣削目标之后就要确定铣削角度。铣削角度对所得到的薄切片长度有很大影响：铣削角度越小，所得到的薄切片越长。此外，薄的细胞，如细菌单层，就需要比较高的细胞更小的铣削角[5] 。
接下来，样品需要使用气体注入系统（GIS）针头涂覆1-3μm厚的铂金层。铂金层可以保护样品的顶面在铣削过程中不被破坏。此外，通过在样品上涂覆铂金层，可以避免遮挡伪影，从而可以获得更高质量的断层图 [6] 。
在开始铣削过程之前，需要定义铣削模式，在此很重要的是要确保薄切片的宽度小于细胞，以确保有支持材料的薄切片。实际的铣削是以递减束流的方式逐步完成的。这些步骤通常被定义为粗铣到〜5微米的厚度，精铣到〜1微米和抛光，最终完成一个100-300纳米厚的薄切片[7] 。
尽管冷冻聚焦离子束和扫描电镜的真空度很高，但室内残余气体中的水分子仍然可以沉积在样品上，从而沉积在最终的薄片上。水的沉积导致冰层遮挡了最终的断层图采集。因此，建议在取回样品之前抛光薄片。然而，这很大程度上限制了可以一次制备的薄切片的数量。因此，在聚焦离子束和扫描电镜内部安装一个冷阱是非常有利的，可以大大减少冰污染 [8] 。
最后，作为一个可选的步骤，样品可以用5-50纳米厚的铂金层溅射涂层，这可以防止电子或离子束电荷的积累。该涂层可以在预铣削阶段就准备好，以达到更好的聚焦离子束和扫描电镜成像和铣削的效果，也会使最终的薄切片有更好的透射电镜成像[1] 。
一旦所有所需的片层被制备好，载网就可以被转移到冷冻透射电镜，获取细胞内部的高分辨率数据。冷冻样品制备是一项重复且耗时的任务，值得庆幸地是目前已有几种方法可以自动化这个过程[9,10]。另外，这个过程也包括很多转移步骤，构成了样品受污染的风险。目前，科研人员正在开发高真空传输系统，以减少转移过程中的污染 [8] ，这些创新将使冷冻聚焦离子束的铣削和冷冻电子断层扫描成为更容易实现的高通量技术，从而帮助大家轻松获得更多的高分辨率结构。
参考文献
1 Wagner, F. R. et al. Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Nature Protocols 15, 2041–2070 (2020).
2 Rigort, A. et al. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology 172, 169–179 (2010).
3 Arnold, J. et al. Site-Specific Cryo-focused Ion Beam Sample Preparation Guided by 3D Correlative Microscopy. Biophysical Journal 110, 860–869 (2016).
4 Klein, S., Wachsmuth-melm, M., Winter, S. L., Kolovou, A. & Chlanda, P. Cryo-correlative light and electron microscopy workflow for cryo-focused ion beam milled adherent cells. Correlative Light and Electron Microscopy IV (Elsevier Inc., 2021). doi:10.1016/bs.mcb.2020.12.009.
5 Villa, E., Schaffer, M., Plitzko, J. M. & Baumeister, W. Opening windows into the cell: Focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Current Opinion in Structural Biology 23, 771–777 (2013).
6 Hayles, M. F., Stokes, D. J., Phifer, D. & Findlay, K. C. A technique for improved focused ion beam milling of cryo-prepared life science specimens. Journal of Microscopy 226, 263–269 (2007).
7 Schaffer, M. et al. Optimized cryo-focused ion beam sample preparation aimed at in situ structural studies of membrane proteins. Journal of Structural Biology 197, 73–82 (2017).
8 Tacke, S. et al. A streamlined workflow for automated cryo focused ion beam milling. bioRxiv 2020.02.24.963033 (2020) doi:10.1101/2020.02.24.963033.
9 Buckley, G. et al. Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural biology. Journal of Structural Biology (2020) doi:10.1016/j.jsb.2020.107488.
10 Zachs, T. et al. Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-electron tomography. eLife 9, 1–14 (2020).