在冷冻电镜的工作流程中，荧光显微镜通常用于识别感兴趣区域以进行图像采集。通常我们会在玻璃化后操作荧光显微镜，以确保荧光显微镜和电镜图像之间的最高相关精度。这意味着在冷冻条件下也可以进行荧光成像。那么，冷冻条件下的荧光成像与常温相比有什么不同？有哪些技术局限存在？我们又将如何克服这些局限性呢？
冷冻荧光显微镜的技术局限性
因为冷冻荧光显微镜的有效分辨率低于荧光显微镜在室温下的分辨率，冷冻荧光显微镜主要被用于相关研究，而很少被用作独立的成像技术。分辨率的差别是由于冷冻条件会限制浸没物镜的使用。在光学显微镜中，浸没物镜的高数值孔径允许以接近衍射极限（〜200nm）的分辨率成像。相反，在冷冻荧光显微镜中使用的空气物镜仅限于较低的高数值孔径，因此只能达到400至500nm的分辨率。
在相关成像中，使用冷冻荧光显微镜的注意事项
冷冻条件改变了荧光显微镜的许多特质。荧光团在非常低的温度下的反应会有所不同，这在给冷冻荧光显微镜带来一些好处的同时也带来了一些挑战。主要的好处是在冷冻条件下，荧光团的漂白作用大大降低了[1]。因为光漂白过程取决于荧光团的分子变化以及与周围的分子， 而在冷冻下，这两种机制均会大大受损， 所以我们在图像采集期间可以使用长时间且高强度的曝光。
另一个好处是，大多数荧光团在冷冻下具有较窄的发射光谱和吸收光谱，从而减少了光谱重叠并允许更好的多色成像[2]。而缺点则是，在冷冻条件下荧光团极有可能被激发到黑暗状态，从而无法发出荧光[3]，这会导致来自样本的总信号显著降低。但是，我们并不知道是否所有荧光团都具有这种特性，科学家正在进行进一步的研究来优化用于冷冻成像的荧光团。
冷冻荧光显微镜的未来将如何发展
冷冻荧光显微镜较低的有效分辨率是将其用作单独技术的最大障碍，尽管我们对能在极其低温下工作的浸没物镜和浸没液的设计已经取得了一些进展[4]，这将能使得冷冻荧光显微镜达到与荧光显微镜在常温下相同的水平。值得令人兴奋的是，科学家发现了荧光团在冷冻条件下仍然能发出“闪烁”的信号，这才允许我们使用超高分辨率冷冻显微镜[5]。这些信息证明了冷冻荧光显微镜在相关研究中的重要性，也为冷冻荧光显微镜作为独立技术被使用铺平了道路。
冷冻荧光显微镜是在冷冻电子断层扫描工作流程中使用的一项重要技术。在此工作流程中，使用冷冻荧光显微镜可以确定感兴趣的区域，然后通过聚焦离子束在扫描电镜中对样本进行稀释，最后将其转移至透射电子显微镜进行成像。在保持样本冷冻状态的条件下，完成样本在显微镜之间的不断转移是此工作流程中一项极具挑战性的任务。
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[1] C. L. Schwartz, V. I. Sarbash, F. I. Ataullakhanov, J. R. Mcintosh, and D. Nicastro, “Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching,” J. Microsc., vol. 227, no. 2, pp. 98–109, 2007, doi:10.1111/j.1365-2818.2007.01794.x.
[2] T. M. H. Creemers, A. J. Lock, V. Subramaniam, T. M. Jovin, and S. Volker, “Three
photoconvertible forms of green fluorescent protein identified by spectral hole-burning,” Nat. Struct. Biol., vol. 6, no. 6, pp. 557–560, 1999, doi: 10.1038/9335.
[3] R. Kaufmann, C. Hagen, and K. Grünewald, “Fluorescence cryo-microscopy: Current challenges and prospects,” Current Opinion in Chemical Biology, vol. 20, no. 1. Elsevier Ltd, pp. 86–91, Jun-2014, doi: 10.1016/j.cbpa.2014.05.007.
[4] R. Faoro et al., “Aberration-corrected cryoimmersion light microscopy,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 115, no. 6, pp. 1204–1209, Feb. 2018, doi: 10.1073/pnas.1717282115.
[5] M. W. Tuijtel, A. J. Koster, S. Jakobs, F. G. A. Faas, and T. H. Sharp, “Correlative cryo super-resolution light and electron microscopy on mammalian cells using fluorescent proteins,” Sci. Rep., vol. 9, no. 1, pp. 1–11, Dec. 2019, doi:10.1038/s41598-018-37728-8.