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冷冻电镜 | cryo-ET工作流程中的冰污染问题及其解决方法

冷冻电子断层扫描(cryo-ET)是一种非常强大的技术,可以在接近原生状态下对细胞结构进行高分辨率的研究。由于厚于600纳米的生物样品不对电子透明,因此需要减薄才能用于冷冻电子断层扫描。为了使样品变薄,使用带有聚焦离子束和冷冻载物台的扫描电子显微镜(cryo-FIB/SEM)已成为黄金标准。

冷冻电子断层扫描(cryo-ET)可以重建蛋白质复合物在其接近原生状态的高分辨率模型。其工作流程是首先将样品(如电镜载网上生长的真核细胞)玻化,然后在扫描电子显微镜(SEM)内使用聚焦离子束(FIB)减薄到适当的厚度(100-300纳米)。最后,用透射电子显微镜(TEM)采集一系列图像。这些二维图像然后用来重建一个三维体积图像,即所谓的断层图。从断层图中,可以重建感兴趣的蛋白质的高分辨率结构模型。在所有这些步骤中,样品始终必须保持在〜-160℃的玻化状态。

目前研究者所面临的冰污染主要有三个来源。第一,污染的液氮在样品上沉积冰晶。在潮湿的环境中,冰晶会在靠近液氮的表面形成。常见的来源是样品提取和制备台、镊子、露华尔甚至大型主液氮罐和软管。这样沉积在样品上的冰晶通常既有能够挡住视野的大晶体(图1a),也有分布在样品上的小晶体(图1b)。样品薄切片上大量的冰污染会直接导致其无法用于断层扫描采集。

避免这种污染的常见处理方式是在一个低湿度的房间里操作样品,并戴上口罩,以避免呼吸直接接触被液氮冷却的表面,另外还要在开始操作前加热容器和工具,以消除其表面的任何水分。然而,即使考虑到所有这些预防措施,目前也不可能完全避免冰晶的形成和一定程度的液氮污染。

冰污染的第二个来源是环境中的水分子沉积在样品上生长出冰晶。当样品在液氮外转移时(如:从制备台到扫描电镜),空气中的水分子会沉积在样品上。因此,液氮外的样品转移应在真空中进行。真空可以减少水的沉积量,也可以最大限度地减少样品变热的可能性。然而,许多转移工具达不到高真空,这意味着水分子沉积仍然会发生,导致样品表面的六边形冰的生长(图1c,星号位置)。为了避免这种情况的发生,样品转移的速度是至关重要的,因此,我们会常常看到研究人员手持转移棒从一台显微镜跑到另一台显微镜的场面。

Figure1

图1冷冻电镜载网上冰污染的示例。 a)概览图显示污染液氮造成的大面积污染。 b)更高倍率地展示图1a样品中覆盖整个样品的小面积冰沉积。 c)在不佳的真空环境中,水分子沉积在样品表面形成的六边形冰晶(星号)污染。图片提供:Sebastian Tacke和Stefan Raunser,Max-Planck-Institut (MPI)分子生理学研究中心,德国多特蒙德。

最后,冰污染甚至可以发生在扫描电镜和聚焦离子束的高真空环境中。虽然高真空保证了最小的含水量,但是样品的冷冻就像一个 "冷阱",室内气态的水分子撞击到冰冷的样品时会升华成冰层。这个过程发生得非常缓慢,但由于铣削过程需要几个小时,在室压约为10-7Bar的情况下,结晶冰的生成速度可以达到大概50纳米每小时[1], 而每个薄切片的铣削时间约为1小时。这意味着在样品的铣削过程中,一个约150 纳米的薄片可以被数倍于自身大小的结晶冰所覆盖。当在冷冻透射电镜中进行分析时,薄切片上的这种结晶冰层会显著降低所得数据的质量。由于目前主要的冷冻扫描电镜供应商都接收这样的冰污染生长速度,这就给用户们带来了压力,他们需要尽可能快地进行铣削过程。为了避免这种情况,最好确保在开始抛光之前,先对所有薄切片进行粗铣,这样可以减少成品薄切片暴露在冰室污染中的时间。自动铣削程序也能够通过提高效率减少铣削时间,从而减少冰的堆积。此外,铣削室中更高的真空度也可以降低铣削室中的水含量,从而抑制冰的生长。

这三个样品污染源共同构成了当前冷冻电子断层扫描工作流程的主要瓶颈。Delmic相信冷冻电子断层扫描是了解生命组成构件的最佳技术,这就是为什么我们致力于改进、简化和自动化冷冻电子断层扫描的工作流程。使用我们的一体化荧光显微镜 METEOR,您已经可以大大减少样品处理和转移的步骤,从而最大限度地减少冰污染。

为了进一步减少您的冷冻电镜工作流程中各个步骤所可能产生的冰污染,我们正在开发一些极具创新性的工具,欢迎注册参加我们即将举行的网络研讨会了解,我们将能够如何帮助您最小化冷冻电镜的冰污染。

参考文献

[1] S. Tacke et al., “A streamlined workflow for automated cryo focused ion beam milling,” bioRxiv, p. 2020.02.24.963033, Feb. 2020, doi: 10.1101/2020.02.24.963033.

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Caspar Jonker