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超快体电子显微镜, 自动超快体成像, 体电子显微镜 • 2 阅读分钟数

电镜制样 | 从层层瓶颈到全流程自动化

样品制备在电子显微镜(EM)中是至关重要的,因为它对最终数据的影响与电子显微镜质量造成的影响一样重大,甚至可能更大。由于其耗时性,它往往被视为生物样品的高通量电镜的瓶颈。这篇文章解释了电镜的样品制备几个关键步骤,并给出了几种可能的解决方案,以加快并自动化这个过程。

在过去的几年里,电子显微镜的速度越来越快,提高了科研产业的整体通量。然而,这种通量的提高只有在样品制备能够跟上图像采集的情况下才能被有效利用。当前的主要瓶颈在于制样过程需要进行几个耗时和重复的步骤来获得高质量的样品。

样品染色和嵌入

在其原生状态下,生物样本无法与电磁兼容。未经处理的样品暴露在电子束和电镜所需要的真空中会迅速受损,无法成像。如今,已有一系列的样品制备技术,并可为特定的研究问题或成像模式进行微调。虽然试剂和策略可能会大相径庭,但任何生物标本都要解决几个基本条件。

首先,标本应产生高电子对比度。重金属染色剂,如四氧化锇或醋酸铀,可用于提高生物样品中细胞器和蛋白质复合物的可见度。其次,样品需要承受显微镜内的真空。丙酮或乙醇可用于样品脱水,然后嵌入丙烯酸或环氧树脂中,确保样品超微结构在真空室中得以保存。第三,样品需要足够薄才能进行电镜成像。因此,从嵌入的标本用超微刀收集切片,并转移到基板上进行成像。最后,样品必须是导电的,以防止电子束的充电,这通常是通过涂层基板或样品与金属或碳的导电层实现。

解决样品制备中的所有这些步骤会很快成为一个耗时的过程,需要耗时的孵化步骤和频繁的试剂交换。因此,我们不断研究新的样品制备方法,目的是加快样品制备速度,提高图像质量。

样品的采集和放置

可靠的切片收集对保持高通量电镜的高质量样品至关重要。手动连续切片是一个耗时的过程,并通常伴有频繁的失误。此外,标本的取放都需要以有组织地进行,以保持样品的组织完整。在大规模电镜项目中跟踪所有单个切片是十分棘手具有挑战性的。任何污染,损坏或位移的部分损失都可能意味着一整个区域的切片需要重做,因为细胞器或结构将不能顺利从一个部分连接到下一个部分。在某些情况下,丢失一个以上的切片已经意味着重建很难实现。

由于样品保存的重要性,许多发展正在改善样品制备工作流程。在整个过程中,样品取放的自动化对提高生物标本的通量起着重要作用。减少切片损失,提高可用样品的比例,跟踪大量样品是这些发展的主要目标。

自动化在制样中的作用

制样的自动化表现在方方面面,从最初的固定和包埋,到切片采集的自动化手段。对于前者,目前一些解决方案已经表现得非常突出,如试剂交换的机器人化,以及能够通过微波加热加速染色和包埋的自动化处理站[1]。这些都极大地减少了获得正确固定和嵌入标本所需的时间和实验室工作量。

切片的自动化是另一个大有前景的发展方向,由于切片过程相当易损,可能需要几个月的时间来学习和掌握要领。与染色和嵌入一样,自动化大大降低了对熟练操作者的需求,使收集数百或数千份切片时失误的可能降到最低。

自动切片目前也已有多种解决方案,比如磁性[2]和基于磁带的收集[3]。其中有一种叫MagC的方法,通过将样品块与装载有磁珠的块结合起来,以简化切片过程。两者被收集在一个单一的截面中,这意味着嵌入的磁珠可以用来将所有的截面聚集到一个大的基板上,从而实现能达到数百甚至数千个截面的非常高的截面沉积密度。这个过程确保了在没有操作者干预的情况下,切片可以持续地被切割。这在斑马鱼大脑的相关研究中已得到了证明,其中研究者使用超微结构体积电子显微镜对神经解剖示踪剂进行了成像。

Delmic的自动化和创新

我们正在开发一个自动化的样品制备工作流程,以支持我们的超快多束电子显微镜FAST-EM系统。我们深知,在生物样品制备自动化的助力下,高通量电镜技术将更快地产生数据,而这也意味着纳米解剖学或连接组学之类的需要超微结构和大体积3D信息的研究领域将发生重大转变。

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参考文献

[1] Zechmann, B., & Zellnig, G. (2009). Microwave-assisted rapid plant sample preparation for transmission electron microscopy. Journal of Microscopy, 233(2), 258–268. https://doi.org/10.1111/j.1365-2818.2009.03116.x 

[2] Templier, T. (2019). MagC, magnetic collection of ultrathin sections for volumetric correlative light and electron microscopy. ELife, 8, 1. https://doi.org/10.7554/elife.45696

[3] Schalek, R., Kasthuri, N., Hayworth, K., Berger, D., Tapia, J., Morgan, J., Turaga, S., Fagerholm, E., Seung, H., & Lichtman, J. (2011). Development of High-Throughput, High-Resolution 3D Reconstruction of Large-Volume Biological Tissue Using Automated Tape Collection Ultramicrotomy and Scanning Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis, 17(S2), 966–967. https://doi.org/10.1017/s1431927611005708

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Josine Beets