冷冻电子断层扫描（Cryo- electron tomography）是一种使用冷冻电镜（cryo-TEM）的成像技术，可在近乎原生的细胞环境中获取高分辨率的3D结构，例如：细胞内细胞器和蛋白质复合物。由于了解蛋白质的位置和结构对于理解细胞功能至关重要，因此该技术近年来变得越来越重要。 冷冻电子断层扫描在增进我们对所有生物过程的理解方面有着十分广阔的前景，而当前的样本制备方法是广泛使用该技术的主要瓶颈。

当前的冷冻电子断层扫描工作流程

在冷冻电子断层扫描中，将样本快速冷冻、稀释至合适的厚度（100-300 nm），然后用透射电子显微镜（TEM）拍摄一系列图像，这些图像则被用于重建称为断层图的3D图像。在所有这些步骤中，样本必须在〜-160°C下保持玻璃化状态，以避免形成结晶冰。

为了产生如此薄的截面，使用聚焦离子束和扫描电子显微镜已成为黄金标准。 聚焦电子束用于研磨掉周围的材料并形成一个薄切片，称为冷冻薄片。确定合适的区域（感兴趣区域），以便在正确的位置进行铣削是至关重要的一步，因为超出此过程的目标范围可能会导致铣削掉您感兴趣的结构。为了克服这个问题，通常使用冷冻荧光显微镜（Cryo-fluorescence microscope）来识别感兴趣区域，并避免“盲”铣削。

在该技术中，荧光标记用于标记感兴趣的结构或蛋白质，然后将其与聚焦电子束亦或扫描电镜的扫描电镜部分一起找到。但是，将冷冻荧光显微镜合并到冷冻电子断层扫描工作流程中会带来许多挑战。首先，在研磨前将样本转移至冷冻荧光显微镜（以识别感兴趣区域）会大大增加样本的处理工作，从而增加污染或损坏样本的风险。在理想情况下，研磨后还应使用冷冻荧光显微镜再次检查样本，以确保不会将感兴趣区域研磨掉。但是，这样做有很大的风险，以至于目前根本没有实验会这样做。其次，要取得荧光图像与聚焦电子束或扫描电镜中图像的关联并非易事。我们需要用标记物来导航到样本上的正确点，并且如果荧光和扫描电镜图像的覆盖图不完全正确，感兴趣区域就可能仍然会丢失或磨掉。

集成式冷冻荧光显微镜的可能性

为了克服这些挑战，Delmic目前正在开发一种可以将冷冻荧光显微镜集成到聚焦电子束或扫描电镜系统中的解决方案。 将聚焦电子束或扫描电镜内部装备荧光显微镜，可大大减少所需的处理步骤，从而减少污染和损坏并大大提高冷冻电子断层扫描工作流程的效率。另外，在荧光显微镜和扫描电镜成像之间自由切换而无需移动样本则可以使扫描电镜和荧光显微镜图像直接相关。这样可以显著加快感兴趣区域的识别速度，并确保在正确的位置执行铣削过程，并且不会危害目标结构。此外，在研磨过程之后，用荧光显微镜重新检查样本的操作也十分容易，从而提高了最终在冷冻电镜中的样本质量。

Delmic的冷冻荧光显微镜系统可以轻松地集成到现有的冷冻电子断层扫描工作流程中，这样的集成毋庸置疑代表着强大的冷冻电子断层扫描技术变得更加轻松高效的重要一步。想要了解更多吗？关注我们的近期推送以获取更多信息！